兔子作為動(dòng)物模型在免疫學(xué)中發(fā)揮了數(shù)十年重要作用。如今，兔仍然是多種用途廣泛的單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)和多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）的主要來源。多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）是針對(duì)特定病原體或抗原產(chǎn)生的針對(duì)不同表位的抗體，單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)是針對(duì)一個(gè)確定的抗原結(jié)合位點(diǎn)(對(duì)應(yīng)表位)，通常只與一個(gè)表位高親和力和特異性結(jié)合的抗體。IgG是兔單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)最常見的同種型。

IgG格式的天然兔抗體示意圖

兔單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)和多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究（如免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡和流式細(xì)胞術(shù)）和臨床藥物開發(fā)（如賽伐珠單抗、布西珠單抗等）。事實(shí)上，兔子自身獨(dú)有的特征使其在上述領(lǐng)域擁有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。首先，兔子屬于Lagomorpha目，它在進(jìn)化上與鼠類嚙齒目不同，兔抗體能夠識(shí)別嚙齒動(dòng)物中非免疫原性的人類抗原上的表位，增加可靶向表位的總數(shù)，并促進(jìn)與人類抗原的小鼠直系同源物交叉反應(yīng)的抗體的產(chǎn)生。這是基礎(chǔ)研究和臨床前研究的一個(gè)重要方面。其次，已經(jīng)觀察到兔子對(duì)小分子和半抗原產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，這在嚙齒動(dòng)物中并不常見。第三個(gè)重要方面是近交兔品系的稀缺性，而大多數(shù)小鼠品系是近交的。人們認(rèn)為，近交系通常會(huì)引起不太多樣化的免疫反應(yīng)，這使得培養(yǎng)強(qiáng)大而多樣化的結(jié)合物變得更加困難。相應(yīng)地，在許多將兔和小鼠單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)與相同的人類抗原進(jìn)行比較的IHC研究中，兔單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)始終顯示出更高的靈敏度。

兔B細(xì)胞和抗體庫的產(chǎn)生

兔B細(xì)胞庫的發(fā)育與其他哺乳動(dòng)物的發(fā)育明顯不同。兔體內(nèi)B細(xì)胞和抗體多樣化主要包括三個(gè)主要不同的發(fā)育階段。B淋巴細(xì)胞生成主要局限在早期發(fā)育過程中，主要的“免疫前”B細(xì)胞庫在出生后的前2個(gè)月內(nèi)在腸道相關(guān)淋巴組織（GALT）中進(jìn)化，以及通過免疫原結(jié)合激活B細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的二級(jí)“免疫”B細(xì)胞庫。

兔B細(xì)胞的個(gè)體發(fā)育與抗體庫

兔子主要先重新排列它們的重鏈，即重鏈的VH-D-JH重組，然后是其作為前B細(xì)胞受體的表達(dá)。在刺激前B細(xì)胞受體后，VL-JL輕鏈重組開始。雖然可能有200個(gè)VH基因在重鏈重排中發(fā)揮作用，但其中大多數(shù)很少表達(dá)或不表達(dá)。僅有10~20個(gè)D基因和4~5個(gè)JH基因被發(fā)現(xiàn)，且這些基因簇中有一部分被優(yōu)先利用: VH1是最接近D的VH基因，存在于80~90%的重鏈基因重排中。此外有相關(guān)研究顯示，在VH1陰性的家兔中，80-90%的重鏈重排都使用了VH4片段。然而，這種重鏈重排在成年兔中非常罕見，這表明VH4重排在大多數(shù)情況下是非生產(chǎn)性的，因此在發(fā)育過程中丟失。

人們普遍認(rèn)為，在重組過程中，兔子通過在VH–D和D–JH連接處添加N-核苷酸，部分抵消了某些VH、D和JH基因的優(yōu)先利用。重鏈的第三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）被稱為HCDR3，它包括兩個(gè)連接，因此是六個(gè)CDR中可變性最強(qiáng)的。與小鼠和人類HCDR3的平均±s.d.長(zhǎng)度分別為11±2（mode=10個(gè)氨基酸）和15±4（mod e=15個(gè)氨基酸）。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)，與小鼠HCDR3相比，兔HCDR3與人HCDR3具有更多的相似性。兔子部分通過在重組過程中在VH-D和D-JH連接處添加N-核苷酸來補(bǔ)償某些VH，D和JH基因的這種優(yōu)先利用。

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兔抗體庫中序列多樣化的分子機(jī)制

盡管在新生兔的B細(xì)胞庫中，重鏈的使用有限，但可以通過使用不同的輕鏈來補(bǔ)償。兔輕鏈有兩種類型——κ 和 λ，κ 輕鏈存在于兩種不同的同種型中，稱為 K1 和 K2。這些兔κ輕鏈同種異型的恒定結(jié)構(gòu)域序列比人類Ig同種異型具有更高的氨基酸序列多樣性，成對(duì)氨基酸序列差異高達(dá)40%。

值得注意的是，與小鼠(IgG1, IgG2a, IgG2b和IgG3)和人類(IgG1, IgG2, IgG3和IgG4)的4種IgG同種型相比，兔子只有1種IgG同種型(1個(gè)Cγ基因)。相比之下，兔子有13個(gè)Cα基因，可產(chǎn)生至少10種功能性IgA同種型，這是已知的最多樣化的IgA系統(tǒng)，而小鼠只有1種IgA同種型，人類有2種。綜上所述，B細(xì)胞個(gè)體發(fā)育和抗體庫的獨(dú)特特征使兔成為產(chǎn)生高親和力和特異性抗體的有價(jià)值的來源。

兔單克隆抗體的制備

兔單克隆抗體具有高親和力、高特異性、高靈敏度，可識(shí)別更多新型表位，容易人源化等特點(diǎn)，兔單克隆抗體開發(fā)治療用于抗體藥物的前景非常廣闊，兔單抗藥物的上市，揭開了抗體藥物研發(fā)的新篇章，發(fā)展?jié)摿Σ豢上蘖俊?/p>

由于兔骨髓瘤細(xì)胞株受專利保護(hù)，無法利用雜交瘤技術(shù)開發(fā)兔單抗，普健生物建立了噬菌體展示抗體文庫技術(shù)平臺(tái)以及新型的 Xten™ Mab Single B 兔單克隆抗體開發(fā)技術(shù)平臺(tái)。

普健生物兔單克隆抗體的制備運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)，可直接在高庫容的兔源天然抗體庫淘選多種靶點(diǎn)?；蚋鶕?jù)客戶需求，定制構(gòu)建針對(duì)某一種或某幾種靶蛋白的兔免疫抗體文庫，篩選高親和力兔單克隆抗體序列，最終重組表達(dá)成完整的兔單抗。

您還可以選用最新的single B篩選路線，從免疫兔脾組織或外周血中分離抗原特異性B細(xì)胞，通過單細(xì)胞PCR技術(shù)從分泌抗體的單個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增IgG重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，然后進(jìn)行重組表達(dá)，獲得大量具有生物活性的單克隆抗體。

快速兔單克隆抗體開發(fā)技術(shù)路線

我們的優(yōu)勢(shì)

多樣性百億級(jí)別兔源scFv天然抗體文庫：

1. 定制化抗體文庫：改良版兩步法建庫方案可最大限度的減少錯(cuò)誤序列，保證抗體庫多樣性和高庫容

2. 高質(zhì)量多維度文庫 QC 報(bào)告：全面體現(xiàn)文庫多樣性分布情況

3. 可接受多類型靶標(biāo)抗體篩選：蛋白，多肽，小分子，細(xì)胞表面蛋白等

4. 可根據(jù)項(xiàng)目要求定制淘選方案：可提供固相淘選，液相淘選和細(xì)胞淘選三種淘選方案，也可根據(jù)具體項(xiàng)目要求組合使用，最大化增加淘選成功率

案例展示

在抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)的推動(dòng)下，兔單克隆抗體已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室研究和診斷和治療應(yīng)用的非常成功的試劑。兔B細(xì)胞獨(dú)特的個(gè)體發(fā)育提供了高度獨(dú)特的抗體庫，其中豐富的體內(nèi)結(jié)合物具有高度多樣性、親和性和特異性。通過噬菌體展示和單個(gè)B細(xì)胞方法獲得兔抗體庫的能力促進(jìn)了兔單抗在許多不同應(yīng)用中的應(yīng)用。