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抗微生物藥物耐藥(antimicirobial resistance，AMR)是全球公共衛(wèi)生面臨的重要威脅。艱難梭菌(Clostridioides difficile，CD)是一種重要的多重耐藥菌，常對大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、四環(huán)素類、頭孢菌素類和氟喹諾酮類呈多重耐藥。該特征使得CD能夠在應(yīng)用廣譜抗菌藥物導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)時進(jìn)行優(yōu)勢生長、產(chǎn)生毒素從而造成艱難梭菌感染(Clostridioides difficile infection，CDI)，同時其產(chǎn)芽孢的特性可造成CD在醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)的廣泛傳播。從2013年開始，CD就被被美國疾病控制和預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)列為最緊迫的公共衛(wèi)生威脅，每年給美國醫(yī)療保健系統(tǒng)造成10億美元的損失。至2019年美國CDC仍將其納入五大抗生素耐藥性緊急威脅之一。
當(dāng)前臨床上推薦治療CDI的抗菌藥物有甲硝唑(metronidazole，MTZ)、萬古霉素(vancomycin)
和非達(dá)霉素(fidaxomicin)。除此之外，有研究表明替加環(huán)素(tigecycline)可有效治療重度CDI，利福昔明(rifaximin)可能有助于預(yù)防CDI復(fù)發(fā)。然而，近年來發(fā)現(xiàn)CD對這些藥物的敏感性較前下降。來自美國休斯頓的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示CDI患者糞便分離株中26%對萬古霉素不敏感，29%對MTZ不敏感；而在肯尼亞內(nèi)羅畢進(jìn)行的另外一項(xiàng)研究顯示對二者不敏感的分離株比例可高達(dá)67%和85%。與此同時，這兩種藥物治療失敗的報(bào)道也并不少見。在國內(nèi)，艱難梭菌不屬于CARSS和CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)監(jiān)測病原菌范疇，但某些小規(guī)模流行病學(xué)研究仍然提示耐藥菌株的存在。Meta分析顯示2007~2013年間我國臨床來源艱難梭菌對利福平的耐藥率為18.3%，對四環(huán)素的耐藥率為46.8%，對甲硝唑和萬古霉素則完全敏感。浙江杭州兩所三甲醫(yī)院2012~2015年間腹瀉患者糞便l來源的411株艱難梭中有15.6%對甲硝唑耐藥，36.3%對四環(huán)素耐藥，所有菌株均對萬古霉素敏感，且產(chǎn)毒株的多重耐藥率(96.4%)遠(yuǎn)高于非產(chǎn)毒菌株(31.4%)。艱難梭菌對抗菌藥物耐藥機(jī)制是多種多樣的。
細(xì)菌對抗菌藥物主要的幾類耐藥機(jī)制在艱難梭菌中均比較常見。艱難梭菌可通過改變藥物結(jié)構(gòu)造成抗菌藥物失效：例如通過轉(zhuǎn)座子Tn4453a和Tn4453b上攜帶的catD編碼的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，對氯霉素伯羥基進(jìn)行乙?；揎棇?dǎo)致藥物失效無法與細(xì)菌50S核糖體亞基結(jié)合；此外某些CD菌株編碼D類β-內(nèi)酰胺酶可破壞β-內(nèi)酰胺環(huán)使頭孢菌素類藥物失去活性。艱難梭菌還可對抗菌藥物靶點(diǎn)進(jìn)行修飾：例如vanCd操縱子的表達(dá)可造成CD肽聚糖前體末端d-Ser修飾，使該位點(diǎn)與萬古霉素的親和力降低。迄今為止，在CD臨床株RpoB利福平耐藥決定區(qū)(rifampin resistance determining region，RRDR)中也已發(fā)現(xiàn)十余種耐藥突變，可能阻礙利福霉素類藥物與靶點(diǎn)RpoB蛋白的結(jié)合。艱難梭菌編碼不同家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對抗菌藥物進(jìn)行主動外排：例如CD中cdeA編碼的MATE家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與氟喹諾酮耐藥有關(guān)，而ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CprABC介導(dǎo)了CD對抗微生物肽的抗耐藥性。生物膜的形成同樣參與了艱難梭菌對藥物的耐受：亞抑菌濃度的萬古霉素和甲硝唑可增強(qiáng)CD生物膜的形成，同時CD生物膜又可耐受更高濃度的甲硝唑(10~100mg/L)和萬古霉素(20mg/L)。除此之外，一些既往未考慮的機(jī)制如可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥(推測編碼N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的萬古霉素耐藥質(zhì)粒pX18-498，甲硝唑耐藥質(zhì)粒pCD-METRO等)，同樣可能在艱難梭菌AMR中發(fā)揮重要作用。
甲硝唑
MTZ是硝基咪唑類抗生素，自20世紀(jì)90年代末以來一直是治療輕中度CDI的首選藥物。然而，自從流行毒株NAP1/027出現(xiàn)后，許多國家陸續(xù)報(bào)道了對MTZ低水平耐藥和異質(zhì)性耐藥的菌株，近年來甚至分離到高水平耐藥株。對MTZ治療響應(yīng)降低的CDI病例報(bào)道也越來越多見。
MTZ是一種前體藥物，攝入菌體后，在胞內(nèi)經(jīng)厭氧菌特有的低氧化還原電位酶促反應(yīng)還原激活，雜環(huán)裂變后形成羥乙基肟酸和乙酰胺。MTZ的殺菌機(jī)制尚不明確，可能為活化反應(yīng)伴隨生成的硝基自由基對厭氧菌產(chǎn)生細(xì)菌毒性，造成細(xì)菌死亡。
CD對MTZ耐藥亦可能涉及多種機(jī)制，其一是藥物還原激活通路的改變。參與藥物氧化還原反應(yīng)的電子傳遞蛋白如丙酮酸黃多辛氧化還原酶PFOR等在該酶促反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，這類蛋白編碼基因的突變參與了耐藥形成。鐵離子作為組成PFOR等電子傳遞蛋白功能性
輔基(如含鐵硫簇)的重要元素，在MTZ還原激活途徑中發(fā)揮重要作用，因此鐵代謝/穩(wěn)態(tài)的變化也被認(rèn)為與CD對MTZ耐藥有關(guān)。
艱難梭菌對甲硝唑耐藥可能與甲硝唑的臨床療效下降有關(guān)。近期研究表明，艱難梭菌對MTZ MIC≥1μg/mL是基于MTZ的初始治療方案臨床治療失敗的獨(dú)立預(yù)測因素。來自美國與歐洲的兩個多中心隊(duì)列RCT研顯示甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)方案下CDI初始治療失敗率接近30%，且后續(xù)出現(xiàn)CDI復(fù)發(fā)的概率總體達(dá)到23%，兩項(xiàng)指標(biāo)均劣于萬古霉素。因此近5年歐洲和美國指南中MTZ地位有所下降，僅推薦用于治療不能耐受或無法獲得萬古霉素/非達(dá)霉素的輕中度CDI初次發(fā)作患者。
萬古霉素
最常見的萬古霉素耐藥機(jī)制是van基因介導(dǎo)的藥物靶點(diǎn)修飾，造成萬古霉素與細(xì)胞壁親和力降低。van系列基因主要介導(dǎo)d-Lac或d-Ser兩種末端修飾。其中，d-Lac修飾(d-Ala-d-Lac)由vanA和vanB基因簇編碼，可造成高水平萬古霉素抗性；d-Ser修飾(d-Ala-d-Ser)由vanC、vanE和vanG基因簇編碼，可造成低水平抗性。多藥外排泵是存在于細(xì)菌細(xì)胞膜中的主動轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中一個主要家族是ATP結(jié)合盒(ATPbinding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，水解ATP供能，對簡單離子或大分子的溶質(zhì)如抗菌藥物進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)外排。已有研究在幾種梭狀芽孢桿菌中證實(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是造成多藥耐藥的主要原因。在CD中，陽離子抗菌肽(cathelicidin antimicrobial peptide，CAMP)可誘導(dǎo)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白操縱子高表達(dá)，從而降低各種CAMP的有效性。
非達(dá)霉素
窄譜抗菌藥物非達(dá)霉素與細(xì)菌RNA聚合酶(RNA polymerase，RNAP)的夾型結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制DNA轉(zhuǎn)錄的起始步驟。自2011年起，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)非達(dá)霉素用于CDI。
非達(dá)霉素耐藥性源于RNAP結(jié)合位點(diǎn)的突變，包括RpoB (Gln1074Lys，Val1143Asp、Gly、Phe)和 RpoC(Gln781Arg，Asp1127Glu，Asp237Tyr)等多種突變。其中，Val1143Asp (MIC>64 mg/L) 和Val1143Gly (MIC=16 mg/L)也存在于非達(dá)霉素耐藥的臨床分離CD菌株中。RpoB的 Val1143Asp突變會影響CD的適應(yīng)性和毒力。Val1143Asp、Val1143Gly 突變的實(shí)驗(yàn)室菌株與其親本菌株R20291相比，整體生長變緩、競爭適應(yīng)性下降且毒素A和B的產(chǎn)生均減少，在 CDI金黃地鼠模型中其毒力也降低。
由于這類耐藥突變伴隨著適應(yīng)性降低，且非達(dá)霉素的窄譜活性對腸道微生物群影響較小，因此如果在治療過程中出現(xiàn)耐藥突變，共生的多種腸道微生物群可能有助于減輕突變帶來的影響。
利福昔明和四環(huán)素類
利福昔明抑制細(xì)菌RNA聚合酶。細(xì)菌RNA聚合酶β亞基RpoB突變是產(chǎn)生利福霉素抗性的主要機(jī)制。這些突變會破壞利福霉素和RpoB的直接相互作用或改變RpoB上的利福霉素結(jié)合口袋(rifamycin-binding pocket)結(jié)構(gòu)。
已發(fā)現(xiàn)CD中存在多處可造成耐藥的RpoB突變，包括Ser488Tyr，Asp492Tyr，His502Asn/Tyr，Arg505Lys，Ser550Phe/Tyr。與其他菌株不同(例如腦膜炎奈瑟球菌和結(jié)核分枝桿菌)，RpoB突變導(dǎo)致CD對利福霉素產(chǎn)生耐藥性的同時不會產(chǎn)生體外和體內(nèi)適應(yīng)性代價。CD對利福霉素的耐藥性發(fā)展迅速，有研究顯示甚至在利福昔明用于CDI期間就可能出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致臨床效果不佳。
四環(huán)素類是靶向細(xì)菌30S核糖體的廣譜抗菌藥物，可阻止氨基酰-tRNA與mRNA結(jié)合從而抑制蛋白質(zhì)翻譯。與利福昔明相比，CD對替加環(huán)素的耐藥率較低。CD通過轉(zhuǎn)座子(例如Tn916、Tn5397和Tn4453)攜帶的各種tet基因(例如tetM、tetW、tetA(P)和tetB(P))編碼的核糖體保護(hù)蛋白即延伸因子(elongationfactor)，介導(dǎo)四環(huán)素類藥物耐藥性的產(chǎn)生。
隨著對耐藥性變遷和耐藥機(jī)制的更好了解，將為抗菌藥物合理應(yīng)用，遏制耐藥菌的產(chǎn)生和播散、新抗菌藥以及新耐藥菌快速檢測試劑盒的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
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